幾種特殊的光學(xué)顯微鏡
（一）暗視野顯微鏡
暗視野顯微鏡不具備觀察物體內(nèi)部的細微結(jié)構(gòu)的功能，但可以分辨0.004μm以上的微粒的存在和運動。因而常用于觀察活細胞的結(jié)構(gòu)和細胞內(nèi)微粒的運動等。
暗視野顯微鏡的基本原理是丁達爾效應(yīng)。當一束光線透過黑暗的房間，從垂直于入射光的方向可以觀察到空氣里出現(xiàn)的一條光亮的灰塵“通路”，這種現(xiàn)象即丁達爾效應(yīng)。暗視野顯微鏡在普通的光學(xué)顯微鏡上換裝暗視野聚光鏡后，由于該聚光器內(nèi)部拋物面結(jié)構(gòu)的遮擋，照射在待檢物體表面的光線不能直接進入物鏡和目鏡，僅散射光能通過，因而視野是黑暗的。操作者通過目鏡觀察到的，是檢物體的衍射光圖像（附圖1-2）。
暗視野顯微鏡的基本使用方法如下：
1．安裝暗視野聚光器（或用厚實的黑紙片制成遮光板，放在普通顯微鏡的聚光器下方，也能得到暗視野效果）。
2．選用強光源，一般用顯微鏡燈照明，以防止直射光線進入物鏡。
3．在聚光器和玻片之間加一滴香柏油，避免照明光線于聚光鏡上進行全反射，達不到被檢物體，而得不到暗視野照明。
4．進行中心調(diào)節(jié)，即水平移動聚光器，使聚光器的光軸與顯微鏡的光軸嚴格位于一直線上。升降聚光器，將聚光鏡的焦點（圖2中圓錐光束的頂點）對準待檢物。
5．選用與聚光器相應(yīng)的物鏡，調(diào)節(jié)焦距，按普通顯微鏡的方法操作。
（二）體視顯微鏡
體視顯微鏡又稱實體顯微鏡或解剖鏡，其成像為正立三維的空間影像，并具有立體感強、成像清晰寬闊、長工作距離（通常為110 mm）以及連續(xù)放大觀看等特點。生物學(xué)上常用于解剖過程中的實時觀察（附圖1-3）。
普通光學(xué)顯微鏡的光源為平行光，因而形成的是二維平面影像；而體視顯微鏡采用雙通道光路，雙目鏡筒中的左右兩光束具有一定的夾角--體視角（一般為12o-15o），因而能形成三維空間的立體圖像。
體視顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的使用方法相近，但更為便捷。二者的主要區(qū)別在于：
1. 體視顯微鏡的鏡檢對象可不必制作成裝片。
2. 體視顯微鏡載物臺直接固定在鏡座上，并配有黑白雙面板或玻璃板，操作者可根據(jù)鏡檢的對象和要求加以選擇。
3. 體視顯微鏡的成像是正立的，便于解剖操作。
4. 體視顯微鏡的物鏡僅一只，其放大倍數(shù)可通過旋轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)螺旋連續(xù)調(diào)節(jié)。
（三）熒光顯微鏡
熒光顯微鏡是利用細胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)射的熒光強度對其進行定性和定量研究的一種光學(xué)工具。細胞內(nèi)的熒光物質(zhì)物質(zhì)有兩類，一類直接經(jīng)紫外線照射后即可發(fā)熒光，如葉綠素等；另有一些物質(zhì)本身不具這一性質(zhì)，但如果以特定的熒光染料或熒光抗體染色，經(jīng)紫外線照射后亦可發(fā)熒光（附圖1-4）。
熒光顯微鏡的原理為利用一個高發(fā)光效率的點光源（如超高壓汞燈），經(jīng)過濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長的光(如紫外光3650λ或紫藍光4200λ)作為激發(fā)光，激發(fā)標本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各色的熒光后，再通過物鏡后面的阻斷(或壓制)濾光片的過濾，最后經(jīng)由目鏡的放大作用加以觀察。阻斷濾光片的作用有二：一是吸收和阻擋激發(fā)光進入目鏡以免干擾熒光和損傷眼睛；二是選擇并讓特定的熒光透過，表現(xiàn)出專一的熒光色彩。
熒光顯微鏡按照光路原理可分為兩種：
1．透射式熒光顯微鏡 較為舊式的熒光顯微鏡，其激發(fā)光源通過聚光鏡穿過標本材料來激發(fā)熒光。其優(yōu)點是低倍鏡時熒光強，而缺點是隨放大倍數(shù)增加其熒光減弱。所以它僅適用于觀察較大的標本材料。
2．落射式熒光顯微鏡 激發(fā)光從物鏡向下落射到標本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡(附圖1-5)。光路中需加上一個雙色束分離器（分色鏡），它與光軸呈45o角，激發(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時進入物鏡，返回到雙色束分離器，使激發(fā)光和熒光分開，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的組合插塊，可滿足不同熒光反應(yīng)產(chǎn)物的需要。此種熒光顯微鏡的優(yōu)點是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數(shù)愈大熒光愈強。
（四）相差顯微鏡
相差顯微鏡是能將光通過物體時產(chǎn)生的相位差（或光程差）轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹ü鈴姸龋┳兓娘@微鏡。主要用于觀察活細胞、不染色的組織切片或缺少反差的染色標本。
人眼只能鑒別可見光的波長（顏色）和振幅的變化，不能鑒別相位的變化。而大多數(shù)生物標本高度透明，光波通過后振幅基本不變，僅存在相位的變化。相差顯微鏡基本把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。光線透過標本后發(fā)生折射，偏離了原來的光路，同時被延遲了1/4λ（波長），如果再增加或減少1/4λ，則光程差變?yōu)?/span>1/2λ，兩束光合軸后干涉加強，振幅增大或減下，提高反差（見圖6）。
從結(jié)構(gòu)上看，相差顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡不同之處在于：
1．環(huán)形光闌
具有環(huán)形開孔的光闌，安裝在光源與聚光器之間，作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐，聚焦到標本上。
2．相位板
相差顯微鏡在物鏡內(nèi)部增加了涂有氟化鎂的相位板，作用是將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。相板上有兩個區(qū)域，直射光通過的部分叫“共軛面”，衍射光通過的部分叫“補償面”。相位板按工作效果分為兩種類型：
（1）A+相板：將直射光推遲1/4λ，兩組光波合軸后光波疊加，振幅加大，標本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加明亮，形成亮反差（或稱負反差）。
（2）B+相板：將衍射光推遲1/4λ，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，標本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加暗淡，形成暗反差（或稱正反差）。
帶有相板的物鏡叫相差物鏡，常在物鏡外殼上標以“Ph”字樣。
3．合軸調(diào)節(jié)望遠鏡
相差顯微鏡配備有一個合軸調(diào)節(jié)望遠鏡（在外殼上標有“CT”符號），用于調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌的像與相板共軛面完全吻合，以便實現(xiàn)對直射光和衍射光的特殊處理。使用時撥去一側(cè)目鏡，插入合軸調(diào)節(jié)望遠鏡，調(diào)節(jié)合軸調(diào)節(jié)望遠鏡的焦點，視野中會呈現(xiàn)兩個圓環(huán)，分別是明亮的環(huán)狀光闌圓環(huán)與較暗的相板上共軛面圓環(huán)。再轉(zhuǎn)動聚光器上的環(huán)狀光闌的兩個調(diào)節(jié)螺旋，使兩環(huán)完全重疊。如明亮的光環(huán)過小或過大，可調(diào)節(jié)聚光器的升降旋鈕，使兩環(huán)完全吻合。如果聚光器已升到最高點或降到最低點而仍不能矯正，說明玻片太厚了，應(yīng)更換。調(diào)好后即可取下合軸調(diào)節(jié)望遠鏡，換回目鏡。
4．綠色濾光片
用于調(diào)整光源的波長。照明光線的波長不同，會引起相位的變化，為了獲得良好的相差效果，相差顯微鏡要求使用波長范圍比較窄的單色光，通常是用綠色濾光片來調(diào)整。
相差顯微鏡的使用步驟如下：
① 根據(jù)待檢標本的性質(zhì)及要求，挑選適合的相差物鏡。
② 將標本玻片放到載物臺上，進行光軸中心的調(diào)整。
③ 使用合軸調(diào)節(jié)望遠鏡，調(diào)整環(huán)狀光闌與相板上的共軛面圓環(huán)完全重疊吻合后，換回目鏡。在觀察過程中，每次更換物鏡倍數(shù)時，必須重新進行環(huán)狀光闌與相板共軛面圓環(huán)吻合的調(diào)整。
④ 加綠色濾光片，按普通光學(xué)顯微鏡的操作步驟進行觀察。
（五）倒置顯微鏡
倒置顯微鏡的結(jié)構(gòu)和普通顯微鏡基本相同，只不過物鏡與照明系統(tǒng)位置交換，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上。主要用于觀察培養(yǎng)的活細胞，需配制相差物鏡。
（六）偏光顯微鏡
普通顯微鏡不同的是：
① 偏光顯微鏡光源前配備偏振鏡（起偏器），使進入顯微鏡的光線為偏振光。
② 鏡筒中有檢偏振鏡（檢偏器，一個偏振方向與起偏器垂直的的起偏器）。
③ 使用旋轉(zhuǎn)載物臺。
當載物臺上放入單折射的物質(zhì)時，無論如何旋轉(zhuǎn)載物臺，由于兩個偏振片是垂直的，顯微鏡里看不到光線，而放入雙折射性物質(zhì)時，由于光線通過這類物質(zhì)時發(fā)生偏轉(zhuǎn)，因此旋轉(zhuǎn)載物臺便能檢測到這種物體。
④ 配備補償器或相位片；
⑤ 使用專用無應(yīng)力物鏡。
（七）電子顯微鏡
電子顯微鏡是利用高速運動的電子束來代替光波的一種顯微鏡。光學(xué)顯微鏡下只能清楚地觀察大于0.2 μm的結(jié)構(gòu)。而小于0.2 μm的結(jié)構(gòu)稱為亞顯微結(jié)構(gòu)（submicroscopic structures）或超微結(jié)構(gòu)（ultramicroscopic structures；ultrastructures）。要想看清這些更為細微的結(jié)構(gòu)，就必須選擇波長更短的光源，以提高顯微鏡的分辨率。電子束的波長要比可見光和紫外光短得多，并且電子束的波長與發(fā)射電子束的電壓平方根成反比，也就是說電壓越高波長越短。因此電子顯微鏡的分辨率遠高于光學(xué)顯微鏡，目前可達0.2 nm，放大倍數(shù)可達80萬倍。
電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)包括鏡筒、真空系統(tǒng)和電源柜三部分。鏡筒主要由電子槍、電子透鏡、樣品架、熒光屏和照相機構(gòu)等部件，自上而下地裝配成一個柱體；真空系統(tǒng)包括機械真空泵、擴散泵和真空閥門三部分，并通過抽氣管道與鏡筒相聯(lián)接；電源柜由高壓發(fā)生器、勵磁電流穩(wěn)流器和各種調(diào)節(jié)控制單元組成。
電子透鏡是電子顯微鏡鏡筒中的關(guān)鍵部件。現(xiàn)代電子顯微鏡大多采用電磁透鏡，由穩(wěn)定的直流勵磁電流通過帶極靴的線圈產(chǎn)生的強磁場使電子聚焦。
電子槍的作用是發(fā)射并形成速度均勻的電子束，由燈絲（陰極）、柵極和陽極（加速極）構(gòu)成。陰極管發(fā)射的電子通過柵極上的小孔形成射線束，經(jīng)陽極電壓加速后射向聚光鏡，起到對電子束加速、加壓的作用。使用中加速電壓的穩(wěn)定度要求不低于萬分之一。
電子顯微鏡按結(jié)構(gòu)和用途可分為透射式電子顯微鏡、掃描式電子顯微鏡、反射式電子顯微鏡和發(fā)射式電子顯微鏡等。其中生物學(xué)研究中使用最為廣泛的是透射式和掃描式電子顯微鏡。前者常用于觀察那些用普通顯微鏡所不能分辨的細微物質(zhì)結(jié)構(gòu)；后者主要用于觀察固體表面的形貌。
（一）透射式電子顯微鏡
透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）的組件包括：
1. 電子槍 發(fā)射電子，由陰極、柵極、陽極組成。
2. 聚光透鏡 即電子透鏡，將電子束聚集，可用于控制照明強度和孔徑角。
3. 樣品室 放置待觀察的樣品，并裝有旋轉(zhuǎn)臺，用以改變試樣的角度，還有裝配加熱、冷卻等設(shè)備。
4. 物鏡 為放大率很高的短距透鏡，作用是放大電子像。物鏡是決定透射電子顯微鏡分辨能力和成像質(zhì)量的關(guān)鍵。
5. 中間鏡 為可變倍的弱透鏡，作用是對電子像進行二次放大。通過調(diào)節(jié)中間鏡的電流，可選擇物體的像或電子衍射圖來進行放大。
6. 透射鏡 為高倍的強透鏡，用將二次放大后的中間像進一步放大后在熒光屏上成像。
7. 二級真空泵 對樣品室抽真空。
8．照相裝置 用以記錄影像。
由于電子易散射或被物體吸收，故穿透力低，樣品的密度、厚度等都會影響到最后的成像質(zhì)量，必須制備更薄的超薄切片，通常為50～100 nm。所以用透射電子顯微鏡觀察時的樣品需要處理得很薄。通常用薄切片法或冷凍蝕刻法制備：
（1）薄切片法 通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，以環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進的方式推進樣品切片，切片厚度20～50 nm，采用重金屬鹽染色，以增大反差。
（2）冷凍蝕刻法 亦稱冰凍斷裂法。將標本置于-100?C的干冰或-196?C的液氮中冰凍后，以冷刀急速斷開標本。斷裂的標本升溫后，冰在真空條件下迅即升華，暴露出斷面結(jié)構(gòu)，稱為蝕刻。蝕刻完成后，向斷面以45o角噴涂一層蒸氣鉑，再以90o角噴涂一層碳，加強反差和強度。然后用次氯酸鈉溶液消化樣品，剝下碳和鉑的膜，稱為復(fù)膜，能顯示標本蝕刻面的形態(tài)。在電鏡下觀察得到的影像即代表標本中細胞斷裂面處的結(jié)構(gòu)。
（二）掃描式電子顯微鏡
掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）于20世紀60年代問世，目前分辨力可達6～10 nm。其工作原理是由電子槍發(fā)射的精細聚焦電子束經(jīng)兩級聚光鏡、偏轉(zhuǎn)線圈和物鏡射到樣品上，掃描樣品表面并激發(fā)出次級電子，次級電子的產(chǎn)生量與電子束入射角有關(guān)，即與樣品的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)。次級電子經(jīng)探測體收集后，由閃爍器轉(zhuǎn)換為光信號，再經(jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘杹砜刂茻晒馄辽想娮邮膹姸?，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標本的表面結(jié)構(gòu)。
掃描電鏡的標本在檢驗前，需進行固定、脫水處理，再噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。