掃描電子偏光顯微鏡樣品的制備及關注
發(fā)布人：shpuda發(fā)布時間：2014/4/23
掃描電子偏光顯微鏡觀察時要求樣品必須干燥，并且表面能夠導電。因此，在進行掃描電鏡生物樣品制備時一般都需采用固定、脫水、干澡及表面被金等處理步驟。
1.固定及脫水
生物樣品的精細結構易遭破壞，因此在進行制樣處理和進行電鏡觀察前必須進行固定，以使其能最大限度地保持其生活時的形態(tài)。而采用水溶性、低表面張力的有機溶液如乙醉等對樣品進行梯度脫水，也是為了在對樣品進行干操處理時盡最減少由表面張力引起的其自然形態(tài)的變化。
將處理好的、干凈的蓋玻片.切割成4-6 mm2的小塊，將待檢而較濃的大腸桿菌懸浮液滴加其上，或將菌苔直接涂上，也可用蓋玻片小塊黏貼于菌落表面，自然干澡后光學偏光顯微鏡下鏡檢，以菌體較密，但又不堆在一起為宜。標記蓋玻片小塊有樣品的一面;將上述樣品置于1% -2%戊二旺磷酸緩沖液(pH7.2左右)中，于4℃冰箱中固定過夜。每次用15%的同一緩沖溶液沖洗，用40%,70%,90%和100%的乙醉分別依次脫水，每次15min，脫水后，用醋酸戊醋置換乙醇。
另一種與之類似的樣品制備方法是采用離心洗滌的手段將菌體依次固定及脫水，最后涂布到玻片上。其優(yōu)點是:①在固定及脫水過程中可完全避免故體與空氣接觸，從而可最大程度地減少因自然干燥而引起的菌體變形。②可保證最后制成的樣品中有足夠的菌體濃度，因為涂在玻片上的菌體在固定及干燥過程中有時會從玻片上脫落。③確保玻片上有樣品的一面不會弄錯。
2.干燥
將上述制備的樣品置于臨界點干燥儀中，浸泡于液態(tài)二氧化碳中，加熱到臨界點溫度(31.4℃,7 376.46 kPa,即72.8個大氣壓)以上，使之氣化進行干澡。
樣品經(jīng)脫水后，有機溶劑排擠了水分，浸占了原來水的位置。水是脫掉了，但樣品還是浸潤在溶劑中，還必須在表面張力盡可能小的情況下將這些溶刑“請”出去，使樣品真正得到干燥。目前采用最多、效果最好的方法是臨界點干燥法。其原理是在一裝有溶液的密閉容器中，隨著m度的升高，蒸發(fā)迅速加快，氣相密度增加，液相密度下降。當赴度增加到某一定值時，氣、液二相密度相等，界面消失，表面張力也就不存在了。此時的沮度及壓力即稱為臨界點。將生物樣品用臨界點較低的物質且換出內(nèi)部的脫水荊進行干燥，可以完全消除表面張力對樣品結構的破壞。目前用得最多的置換荊是二飯化碳。由于二級化碳與乙醇的互溶性不好，因此樣品經(jīng)乙醉分級脫水后還需用與這兩種物質都能互溶的“媒介液一險酸戊陳炭換乙醉。
3.噴鍍及觀察
將樣品放在真空鍍腆機內(nèi)，把金噴鍍到樣品表面后，取出樣品在掃描電鏡中進行觀察。
試驗報告
1:結果
繪圖描述你所制備的大腸桿菌和pBR322質粒DNA電鏡制片在電子偏光顯微鏡下觀察到的形態(tài)特點。
2.思考題
(1)利用掃描電子顯微鏡來觀察的樣品為什么要放在以金屬網(wǎng)作為支架的火棉膠膜(或其他膜)上，而掃描電子顯微鏡則可以將樣品固定在蓋玻片上觀察?
(2)用負染法制片時，磷鎢酸鈉或礴鎢酸鉀起什么作用?
(3)你還知道哪些電子偏光顯微鏡樣品制備技術?你認為可以用透射電鏡觀察樣品內(nèi)部結構而用掃描電鏡觀察樣品表面結構嗎?
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